třepačky a i přes požadavky na zvýšení objemů zpracovávaného produktu se stranní fermentorů. Kvůli časové náročnosti nebo pro obtížnou manipulaci a nutný dohled. Zkusme si tyto fámy rozbít a zjednodušit si práci. ">
K používání a měření webu využíváme cookies. Používáním tohoto webu souhlasíte se způsobem, jakým s cookies nakládáme. Další informace

Přechod z orbitální třepačky na bioreaktor

Přechod z orbitální třepačky na bioreaktor

Orbitální třepačka je v praxi velmi jednoduché zařízení. Uživatel upevní baňky s médiem, nastaví teplotu a otáčky, které mu poradil jeho předchůdce, než odešel do důchodu a po stejně zděděné době třepání je hotovo. Funguje to tak 10–20 let, tak proč to teď měnit?

Dříve lidé tlačili pluh na svých polích a vše obdělávali ručně. Taky to fungovalo. Vzít tehdejšího sedláka do kabiny moderního traktoru John Deere, asi by se pokřižoval a začal utíkat před složitostí ovládání tlačíky, páčky, dotykovými displeji a pedály. V klidnějším provedení se s něčím podobným u některých uživatelů orbitálních třepaček setkávám i dnes. 

Pokud čtete tento článek, asi přechod z třepačky k fermentoru zvažujete. Pojďme si nejprve shrnout fakta. 

  • Fermentory se vyvíjí – ta věc se kterou vás nutili pracovat na vysoké škole patrně neodpovídá současné podobě bioreaktoru (pokud jste zrovna nedostudovali). Dnešní fermentor INFORS HT vypadá diametrálně odlišně od svého předchůdce z 80. nebo i 90. let minulého století. Je menší, jednodušší a pokročilejší řídící jednotky vás povedou krok za krokem. Navíc vás nenechá udělat závažnou chybu, která by ohrozila vás, přístroj nebo okolí. Pravda, tento bod hodně záleží na výrobci a jeho snahu o inovace. Některé značky stále nabízejí stejný model jako v 90. letech, jiné zase nezměnily nic, kromě barvy, posledních 10 let. 
  • Servis – když Biotechnologická hala MBÚ AV ČR v 60. letech pořídila fermentory ze Švýcarska, tak nějak bylo jasné, že výrobce nebude schopen pravidelně dojíždět do Prahy kvůli servisu. Nebyl zde žádný oficiální distributor, ani internetová vědomostní základna. Dnes je na českém trhu několik dealerů světových značek a je na vás vybrat toho, který umí více, než jenom dodat bioreaktor. Dnešní fermentory neopraví závodní zámečník - je potřeba dobře školený servis.
  • Podpora – dnes už můžete chtít víc, než jenom aby přístroj fungoval. Někteří výrobci věnují hodně úsilí do tzv. "after-sale support" (po-prodejní péče). Ať už lokální distributor, sám výrobce nebo oba společně by vám měli být schopni nabídnout pomocnou ruku při rozběhnutí první fermentace a být otevřeni vašim následným dotazům. 

Důležité je si porovnat poměr mezi náročností a výsledky. Fermentor vychází téměř vždy lépe, než je tomu u třepačky. Tento článek si klade za cíl ukázat, jak vypadají vstupy pro toto posouzení - náročnost přípravy od rozbalení krabice s fermentorem až do spuštění první fermentace. Výstupy se budou lišit, podle typu zpracovávaného produktu. Pokud se na nás obrátíte, zkusíme s výrobcem najít ukázkový příklad právě pro vaši aplikaci. 

Příprava na první fermentaci

Vybalení a sestavní bioreaktoru by měl vždy zajistit dodavatel. Naproti tomu není na škodu, když uživatel má podvědomí o tom, co vlastně přístroj pro svou funkci potřebuje. V tomto článku si vezmeme za příklad model Minifors, který je navržen právě s ohledem na uživatele přecházející z orbitálních třepaček k opravdové fermentaci. V našem případě budeme počítat s fermentací bakterií (např. E.Coli). Uživatelé se zájmem o fermentaci tkáňových kultur (hmyzí, savčí nebo rostlinné buňky) se na nás mohou obrátit a my jim rádi informace doplníme. 

Požadavky na média

Je dobré je chtít od dodavatele, ještě před samotnou koupí přístroje. Pečlivý prodejce se nebude zdráhat k vám vyslat servisního technika, který provede obhlídku místa instalace a bude s vámi konzultovat přípravu. 

  • Elektřina - stolní bioreaktor bude potřebovat obyčejnou zásuvku 230V, s 1 fází a jističem 16 A, což je standard i v domácnostech. V tomto se neliší nijak od třepaček. Je vhodné ale pamatovat na zásuvky také pro obslužný počítač, monitor a případně tiskárnu. 
  • Voda - konkrétně Minifors jí nepotřebuje. Dokáže topit na obvyklých 37°C bez napojení na vodu. Ta je ale potřeba k chlazení. Zvažte, zda-li není lepší mít o starost méně a přístroj na vodu připojit. Ten tak bude schopen udržovat teplotu i během horkých letních dnů v místnosti bez klimatizace. Nejste-li schopni celoročně zajistit v místnosti teplotu do 25°C, doporučujeme vodu připojit. Tlak je potřeba kolem 2 barů. V běžném kohoutku na zdi je kolem 6 barů a tak je případně potřeba tlak zredukovat ventilem. 
  • Plyny - výhodou bioreaktoru je lepší provzdušňování média. Jestli jste ve třepačce plyny nikterak neřešili, bude stačit napojení na stlačený vzduch (opět kolem 2 barů). V případech, že v laboratoři rozvod vzduchu nemáte, je vhodné říci dodavateli bioreaktoru také o malý, laboratorní kompresor (cca 30 tisíc Kč). Nelze použít jakýkoliv - kromě tlaku je také dobré se zaměřit na čistotu vzduchu. Vedle vzduchu je možné také připojit kyslík - ten pomůže ještě lepšímu okysličování fermentovaného média. Při absenci rozvodu čistého kyslíku lze pořídit malý kyslíkový koncentrátor (cca 30 - 50 tisíc Kč). 
Bioreaktory jsou ideální pro anaerobní kultivace - namísto vzduchu je potřeba napojení na inertní plyn (dusík nebo CO2). 
  • Prostor - může to znít nepatřičně, ale jde o poměrně důležitý prvek. Zrovna přístroje INFORS HT jsou asi nejméně náročné bioreaktory na prostor, ale přesto je dobré pamatovat na místo pro manipulaci a samozřejmě brát ohled na vzdálenost přípojek na média. 

Příprava na sterilizaci kultivační nádoby bioreaktoru

Abychom v bioreaktoru zajistili sterilní podmínky, je potřeba kultivační nádobu nejprve sterilizovat. Ostatně doposud jste patrně podobný postup používali u baněk určených do třepačky. Do autoklávu ovšem přijde celá kultivační nádoba včetně hlav peristaltických pumpiček, regenčních lahviček s kyselinou / zásadou a samozřejmě také sondy pH a případně pO2

Nyní je dobrá chvíle pro shlédnutí videa o přípravě Miniforsu pro první fermentaci. Celý následný text tak bude lépe pochopitelný.

Kalibrace pH sondy

Kalibrace pH se provádí stejně jako u jakéhokoliv obyčejného pH metru. Ideálně použijeme 2-bodovou kalibraci za použití roztoků s nízkým a vysokým pH faktorem.

  • U nové sondy odřízneme záslepku na boční straně
  • ponoříme sondu do roztoku s vysokým pH (např. pH 8). Do roztoku přijde také teplotní sonda pt-100 ze které si fermentor odečte teplotu
  • po ustálení hodnoty na displeji bioreaktoru potvrdíme nastavení vysokého bodu pH
  • sondu důkladně opláchneme vodou
  • ponoříme sondu (opět s pt-100 teplotním čidlem) do roztoku s nízkým pH (např. pH 4)
  • až nám displej zobrazí hodnotu roztoku, potvrdíme kalibraci

Obdobným způsobem můžeme kalibrovat i pO2 sondu. Samozřejmě, na místo roztoků s vysokým a nízkým pH použijeme kyslík / dusík nebo vzduch v případě jednobodové kalibrace. Nesmíme zapomenout do kyslíkové sondy doplnit elektrolyt. 

Osazení kultivační nádoby

Když máme sondy připravené, můžeme je umístit do kultivační nádoby. V případě modelu Minifors je víko navrženo tak, aby jednotlivé prvky nebylo možné zapojit špatně. Kromě sond bude třeba víko doplnit o inokulační ventil pro pozdější očkování média, průchodku pro přidávání kyseliny / zásady (případně antifoam), Exit Gas Cooler a samozřejmě průchodku pro odběr vzorků. Před vložením poslední součásti je samozřejmě nutné port použít pro naplnění kultivační nádoby médiem na úroveň pracovního objemu, pokud jste tak neučinili předtím. 

Nyní stačí připojit reagenční lahvičky. Pro regulaci pH většina uživatelů používá pouze kyselinu nebo zásadu, protože fermentovaný produkt zpravidla potřebuje upravovat pH pouze jedním směrem. 

Tip: Přípravu a samotnou sterilizaci kultivační nádoby podrobně rozebíráme v článku Sterilizace kultivační nádoby bioreaktoru.

Očkování bioreaktoru

Po vyjmutí nádoby z autoklávu ji připojíme zpět k fermentoru a odstraníme alu fólie, kterými jsme obalili všechny periferní přípojky. Můžeme už připojit pH a pO2 sondy, pt-100 teplotní sondu, přívod plynů a samozřejmě nasadit plastové hlavy pumpiček na hřídele - pozor na záměnu kyseliny a zásady! Nyní je také dobré již spusti program IRIS, který bude zaznamenávat nastavené a skutečné hodnoty. 

Minifors reguluje teplotu pomocí alu bloku a tak rovnou můžeme aktivovat nastavení teploty a nastavit požadovanou hodnotu. Stejně tak nic nebrání aktivaci parametru pH. Aby oba zmíněné parametry fungovali, je nutné zapnout míchání. 

Jaké nastavit otáčky

Zatímco orbitální třepačky pracují běžně rozsahu 150 - 250 RPM, u bioreaktoru se počítá s diametrálně odlišnými hodnotami. Nejde totiž už o třepání, ale o míchání pomocí rushtonových lopatek. Nelze přesně říci, jakou hodnotu máte nastavit, pokud jste u třepačky používali XXX RPM. 

Většina bakteriálních fermentací se pohybuje v rozmezí 300 - 1500 RPM, kde záleží na faktorech jako velikost kultivační nádoby, typ plynu pro okysličování apod. 

Nejste-li si jisti nastavením správných parametrů pro vaši fermentaci, neváhejte se na nás obrátit nebo se podívejte do download centra INFORS HT.

Inokulace

V praxi má očkování fermentoru mnoho podob. U fermentací s nízkým rizikem kontaminace (streptokoky) jsem viděl uživatele jednoduše odšroubovat záslepku na víku a vsříknout inokulum do nádoby. Není to zrovna postup podle GMP, ale někomu to může stačit. 

Dlouhá léta byla standardem metoda s použitím alkoholu a hořáku. Do inokulačního portu stačilo nakapat několik kapiček alkoholu na silikonovou membránu, zapálit a propíchnout inokulační jehlou. Opět z praxe vím, že řada uživatelů tuto metodu provozuje bez ohně a dokonce i opakovaně používá jednorázovou membránu. 

Další možnou metodou je využití volné peristaltické pumpičky k přečerpání inokula z lahvičky do bioreaktoru. Standardem spíše u větších bioreaktorů je tzv. push-valve, který se sterilizuje zvlášť v autoklávu, ale samotné očkování pak spočívá pouze v otočení závitu. 

Po očkování je potřeba akorát program IRIS jedním kliknutím přepnout do režimu fermentace - tím se aktivuje zobrazování alarmových hlášek a oddělený záznam procesu. 

Během fermentace

Není pravda, že by bylo nutné u bioreaktoru držet neustálý dohled a sledovat, co se děje. Fermentor jenom sleduje mnohem více parametrů oproti orbitální třepačce. Vše navíc zaznamenává program IRIS, který sice není nutný pro průběh fermentace, ale neznám uživatele, který by jej nepoužíval. 

Automatizace

Proti orbitální třepačce lze navíc bioreaktor naučit předem daným procedurám při nastalých situacích. Nejedná se o recept, ale tzv. kontrolní sekvence. Ty se sepisují formou programovacího jazyka fungují asi takto:

  • Když pO2 < 40%
  • zvýšit RPM = +20%
  • čekat 120
  • když pO2 < 40%
  • zvýšit Flow = +10%
  • čekat 240
  • když pO2 < 40%
  • aktivovat O2

Jde vlastně o jednoduchou kaskádu pro případ nedostatečného okysličování. Když bioreaktor zjistí míru okysličování pod 40%, nejprve zvýší otáčky o 20%, poté počká 2 minuty. Pokud to nezabere, zkusí přidat na průtoku vzduchu 10% a opět počkat, tentokrát 4 minuty. Jako poslední záchrana se akvituje kyslíkový ventil a začne přidávat do kultivační nádoby spolu se vzduchem čistý kyslík. Možnosti kontrolních sekvencí jsou de facto neomezené.

Odběr vzorků

Odebrat vzorek z bioreaktoru není tak jednoduché, jako vyjmou baňku ze třepačky, to je pravda. Nicméně zase si lze zvolit odebíraný objem a proceduru často opakovat. V případě přístrojů INFORS HT mají uživatelé výhodu systému Super Safe Sampler, který umožňuje odebrat vzorek sterilně ve 3 jednoduchých krocích. 

Závěr

Stručně jsme si sepsali proceduru fermentace. Bioreaktor zpravidla nabídne mnohonásobně vyšší výtěžnost, než kterákoliv orbitální třepačka. Umožňuje nám také kultivaci vypilovat díky sledování a záznamu řady parametrů (zejména vzdušnění), zatímco často v praxi moc netušíme, co se v orbitální třepačce opravdu děje.

Fermentor ani nemusí být dražší, než inkubovaná třepačka. Dobře vybavený Minifors s pracovním objemem 3,3 litru se pohybuje v rozmezí 500 - 600 tis. Kč, což je obdobná cena jako třepačka Multitron Pro s chlazením.