K používání a měření webu využíváme cookies. Používáním tohoto webu souhlasíte se způsobem, jakým s cookies nakládáme. Další informace

Měření integrované biomasy v třepacích baňkách

Měření integrované biomasy v třepacích baňkách

Navzdory popularitě, kterou si třepací baňka vysloužila jakožto malý bioreaktor, zůstávala „černou skříňkou“, co se týče procesů, které během kultivace v inkubační třepačce probíhají. Kontinuální měření biomasy v třepačce v reálném čase pozvedá bio procesy na novou úroveň, od kultivačního systému „černé skříňky“ k integrovanému řešení pro bio procesy s důkladnou kontrolou prostředí a srozumitelným zpracováním informací od samotného počátku.

INFORS HT nabízí srozumitelný a uživatelsky příjemný integrovaný systém pro kultivaci a monitorování biomasy, který vzniká spojením INFORS HT třepaček s online systémem pro měření biomasy Aquila Biolabs CGQ (Cell growth quantifier) při zachování nejlepší možné ceny, výkonu a možností rozšíření. Tento článek se zaměřuje na mikrobiální bioprocesy vzhledem k tomu, že pro technologii CGQ u buněčných procesů savců je stále třeba další výzkum.

Úvod

Navzdory popularitě, kterou si třepací baňka vysloužila jakožto malý bioreaktor, zůstávala „černou skříňkou“ co se týče procesů, které během kultivace v inkubační třepačce probíhají. Přesto, že moderní inkubační třepačky umožňují důkladnou kontrolu faktorů jako rychlost třepání, teplota nebo vlhkost, většina uživatelů u monitorování kultivace stále spoléhá na manuální odběry vzorků a na jejich následnou jednotlivou analýzu. Určení těchto jednoduchých, ale zásadních parametrů jako biomasa, nebo rychlost růstu, vyžaduje přerušení procesu fermentace, odstranění třepacích baněk pro odebrání vzorků a manuální vyhodnocení každého individuálního vzorku za pomocí stolního spektrofotometru. Je žádoucí, aby byl tento únavný a repetitivní úkon nahrazen. K tomu je třeba zapojit technologii, která umožní dosáhnout požadovaného výsledku. Zatímco automatizovaný monitoring pH, pO2 /DO nebo CO2 byly u kultivace prostřednictvím třepání implementovány během poslední dekády, stále chybí dostatek informací o nejdůležitějším parametru v procesu buněčné kultivace: biomase, nebo dalších veličinách, na jejichž základě lze kvantifikovat koncentraci nebo počet buněk v kultivačním roztoku. Plně integrované řešení pro kontinuální, neinvazivní a online měření biomasy se až dosud zdálo být nedosažitelné.

Integrovaný systém dodávaný společností INFORS HT se zaměřuje na měření biomasy a představuje cestu k „otevření černé krabičky“ a k osvětlení procesů, které v třepací baňce probíhají během jakéhokoliv momentu. Protože je měření biomasy klíčovým parametrem mnoha bioprocesů, může opora poskytovaná těmito měřeními přinášet výrazné výhody.  

Pokud chceme docílit specifické hustoty kultury, data v přímém přenosu indikují dosažení konkrétní hodnoty. Tyto kultury jsou pak v optimálním stavu k dalšímu zpracování.

Na základě nepřetržitého toku dat ve vysokém rozlišení se kinetické ukazatele růstu stávají přístupnými pro uživatele a zajišťují výrazně hlubší vhled do stavu kultivace než prahové hodnoty. Prostřednictvím zařízení lze jednoduše identifikovat exponenciální, stacionární a další růstové fáze, dále diauxický růst, omezení kyslíku, inhibiční účinky, a dokonce i morfologické změny. Rychlý sběr dat a statistická analýza vhodná pro srovnávací studie jsou prospěšné pro optimalizaci procesů, screening médií, studie toxicity, profilování růstu, výběr mutantů atd. Integrace a automatizace umožňují vylepšení laboratorního pracovního procesu, analýzu dat a ověření specifických metod. Průmysloví i akademičtí uživatelé těží jak z rychlosti procesu, tak z odstranění rizik spojených s manuálním vzorkováním. Jednotnost výsledků vede ke redukci prostojů, zbytečného opakování pokusů a špatných výsledků.

V systému určeném pro práci s třepacími kulturami je nezbytné, aby byla používána robustní a spolehlivá technika, která dokáže pojmout širokou škálu médií a podmínek determinujících růst. Detektory pracující na principu rozptylu světla, disponují žádoucí kombinací přesnosti, rozsahu a necitlivosti vůči proměnným jako např. zbarvení média. Celek je v případě integrovaného systému více než je souhrn částí, je zaručena vzájemná kompatibilita a kvalifikovaná podpora systému. Budoucnost biologického zpracování směřuje k větší integraci a automatizované interakci mezi typy zařízení. Více integrovaná zařízení s automatizovanou interakcí mezi různými typy zařízení představují budoucnost bioprocesů – zajištění těchto výhod hned na začátku řetězce bioprocesu představuje významný krok kupředu.  

Požadavky na systém

Pro představení integrovaného systému pro měření biomasy v třepačkách s vylepšenou použitelností a aplikací je v první řadě nutné definovat klíčové požadavky běžných uživatelů a popsat funkce, které umožní zvolit vhodné řešení. Požadavky, které většina uživatelů považuje za důležité, jsou shrnuty a specifikovány v tabulce 1. 2

PožadavekPopis
Neinvazivní měření Není třeba přerušovat kultivační proces a vyjímat baňky z inkubátoru.
  • Vyvarování se závad teploty a vlhkosti.
  • Vyvarování se špatného míchání a narušení limity kyslíku.
Kontinuální, paralelní a v reálném čase Kontinuální a paralelní sběr dat bez prodlev, umožňující sledování v reálném čase a vyhodnocení růstu buněk u více kultivací současně.
Přesnost a odolnost vůči šumu Zajištění optimální přesnosti pro širokou škálu aplikací. Pro vizualizaci a analýzu dat je nutné implementovat správné zpracování šumu během sběru, odstranění šumu dat nebo technologii k vyhlazení dat.
Vhodné pro jakýkoli organismus Monitorování biomasy by mělo být možné pro každý organismus, který lze kultivovat v inkubační třepačce.
Vhodný pro jakékoli třepací baňky a jakékoliv nastavení inkubace Velikost, typ, kapacita a pracovní rozsah inkubační třepačky v integrovaném systému, stejně jako velikost, typ a způsob upevnění třepacích baněk nejsou při měření biomasy překážkou.
Možnost propojení s vizualizačním, archivačním a analytickým softwarem Kvalita jakéhokoliv monitorovacího systému závisí na zpracování generovaných procesních dat. Základní funkce, jako je mapování, archivace a export jsou vylepšeny díky schopnosti převádět nezpracovaná data na smysluplné informace s pomocí statistické analýzy a anotací.
Jednoduché nastavení a kalibrace Protože čas je v případě bioprocesů rozhodující, musí být monitorování biomasy rychle nastavitelné a poté snadno použitelné na každodenní bázi. Jednoduché a rychlé by měly být i fyzická manipulace, kalibrace a správa dat.
Korelace s existujícími metodologiemi Umožňuje uživatelům korelovat data biomasy online s existujícími měřeními, jako je například měření optické hustoty offline při 600 nm nebo suché hmotnosti buněk.

Tabulka 1: Specifikace obecných požadavků integrovaného systému pro sledování biomasy v třepačkách.

Řešení od společnosti INFORS HT

Implementace uvedených funkcí do jednoho komplexního a uživatelsky přívětivého integrovaného systému pro kultivaci a monitorování buněk bylo dosaženo kombinací inkubačních třepaček INFORS HT s on-line systémem pro měření biomasy z aquila biolabs CGQ (Cell Growth Quantifier), který navíc poskytuje nejlepší cenu, výkon a možnosti rozšíření. Níže představíme podrobnosti:

Neinvazivní měření

Monitorování biomasy je založené na senzorovém poli namontovaném na desce, která je umístěna pod protřepávací baňkou. Jak je znázorněno na obrázku 1, LED diody vyzařují světlo skrze dno třepací baňky do kultury a světlo, které je zpětně rozptýleno buňkami, je okamžitě a kontinuálně měřeno detektorem. Tento signál zpětného rozptylu se zvyšuje společně s biomasou a neinvazivním způsobem poskytuje růstové křivky s vysokým rozlišením (obrázek 3) a zároveň zabraňuje negativním vedlejším účinkům zastavení a restartování inkubátorové třepačky jako např. problémům s teplotou nebo vlhkostí, špatnému míchání a přechodnému narušení limity kyslíku.

Obrázek 1: Monitorování biomasy pomocí detekce zpětného rozptylu světla - architektura snímání CGQ.

Kontinuální, paralelní a v reálném čase

Monitorování všech baněk jednotlivě je umožněno tím, že jsou data biomasy získávána nepřetržitě v reálném čase na každé senzorové desce, která disponuje dostatečnou hustotou dat. Výsledkem tohoto postupu jsou data ve vysokém rozlišení a kvalitě, což je nedocenitelné pro jakékoliv aplikace související se studiemi kinetického růstu. Datové toky z více senzorových destiček jsou sdruženy v centrální stanici a posílány do místního počítače přes USB. Z jedné centrální stanice lze provozovat až 16 senzorových desek: to umožňuje bezprecedentní paralelizaci online monitoringu kultivací v třepačce v reálném čase. Díky integrovanému systému pro měření a kultivaci biomasy INFORS HT poprvé umožňuje uživatelům sledování a získávání poznatky z každé jednotlivé baňky v inkubátoru.

Přesnost a odolnost proti hluku

Snímač světla se zpětným rozptylem je navržen pro optimální přesnost v prostředí, které je vystavené neustálému třepání. Jedinečná technika sběru dat a algoritmy zpracování dat pracují na podvzorkování na úrovni mikrosekundy a dokážou extrahovat data z otřesů vyvolaných fluktuací intenzity, které se projevují zvukem třepání a které poškozují další nejmodernější senzory.

Obrázek 2: Senzorová destička CGQ monitoruje všechny druhy protřepávacích baněk pomocí vhodného univerzálního adaptéru. 100 ml senzorová destička 250 ml univerzální adaptérová senzorová destička fpr 250 ml baňka

Pro dosažení maximální citlivosti zabraňuje zatemňující kryt umístěný nad třepacími baňkami vlivu okolního světla na měření zpětného rozptylu. Software CGQuant poskytuje nástroje pro vyhlazování dat a potlačení šumu v extrémně hlučných prostředích, jako jsou baňky vystavené silnému třepání.

Vhodné pro jakýkoli organismus

Integrovaný monitorovací systém biomasy INFORS HT je schopen poskytovat přesné výsledky pro širokou škálu bakterií, kvasinek a hub v mnoha různých růstových médiích. Tabulka 2 uvádí organismy, které byly úspěšně monitorovány. Konkrétní informace týkající se médií, organismů a příkladných růstových křivek jsou k dispozici na vyžádání.

Typ buněkOrganismy
Bakterie Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Gluconobacter oxydans, Pseudomonas putida, Streptomyces venezuelae, Vibrio natriegens, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus plantarum, Actinobacillus pleuropneumoniae, Chromobacterium violaceum, Acetobacterium woodii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium ljungdahlii, Prevotella copri, etc.
Archaea Sulfolobus acidocaldarius, Haloferax
Houby / Kvasinky Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, Ustilago maydis
Algae / Rostlinné buňky Chlorella vulgaris, Nicotina tabacum BY-2

Tabulka 2: Organismy, které byly kultivovány prostřednictvím INFORS HT integrovaného systému pro měření biomasy

Vhodné pro jakékoli třepací baňky a inkubační nastavení

Pomocí jednoho typu senzorové destičky a sady univerzálních adaptérů (viz obrázek 2) lze monitorovací systém biomasy využit pro velikosti baňky od 100 ml do 5 000 ml celkového objemu, vyrobené buď ze skla nebo jednorázových plastů. Pro připevnění baňky lze podle potřeby použít standardní svorky z nerezové oceli nebo zelený „Sticky Stuff“ od INFORS HT. Senzor biomasy byl optimalizován pro podmínky vysoké oxidace s objemem náplně 5–15 %. Měření ale mohou být prováděna i u nižší úrovně plnění a také objemů plnění nad 20 %, za cenu určitých kompromisů ohledně citlivosti měření. V kombinaci se svorkami z nerezové oceli je k dispozici celá řada rychlostí třepání pro monitorování biomasy. Aplikace vyžadující vzorkování těží ze synchronizace třepáním, která automaticky pozastaví měření biomasy, jakmile je inkubátor třepačky otevřen.

Propojení dat biomasy s vizualizačním, archivačním a analytickým softwarem

Údaje o biomase z jedné nebo více baněk jsou přenášeny ze centrální stanice umístěné v třepacím inkubátoru na počítač se systémem Windows, na kterém je spuštěn CGQuant. Centrální software zajišťuje funkce týkající se kontroly měření, mapování v reálném čase, porovnání dat, statistické analýzy opakovaných měření, archivace, anotace a exportu dat. Uživatelé integrovaného měřícího systému biomasy INFORS HT získají přístup k sadě nástrojů, která umožňuje efektivní řízení procesů, identifikaci příslušných procesních událostí, podrobnou analýzu dat a racionalizované generování znalostí v souladu s požadavky moderních procesů „Design-of-Experiment“.

Jednoduché nastavení a kalibrace

Fyzické nastavení v inkubační třepačce je rychlé a snadné. Po namontování mohou být desky senzoru použity s různými velikostmi lahví pouze výměnou adaptérových desek. Centrální rozbočovač je připraven pro spojení až s 8 senzorovými deskami, případně s alternativním rozbočovačem schopným zvýšit tento počet na 16. Kabelové spojení vede z každé senzorové desky k rozbočovači, který je jedním kabelem připojen k počítači s CGQuantem. Software pak zpracovává konfiguraci experimentu, vizualizaci dat a anotaci. Data lze exportovat jako obrazové soubory nebo jako kompletní reporty ve formátu XLSX nebo PDF pro další použití a archivaci. Kalibrace používá známou techniku sestrojení standardní křivky a celý proces je veden softwarem. Kalibrační data lze uložit pro opětovné použití a dříve shromážděné datové sady lze následně kalibrovat pomocí nově vygenerovaných kalibračních souborů.

Korelace s existujícími metodikami

Přímé srovnání s offline měřením optické hustoty v externím spektrofotometru má dobré výsledky, software je navíc speciálně upraven tak, aby shromažďoval kalibrační údaje, které umožňují vypočítat offline měření biomasy z dat zpětného rozptylu. Je ale samozřejmě nutné vzít v úvahu praktické problémy spojené s externími manuálními měřeními. Různé organizmy, média a dynamické podmínky tekutin vyžadují samostatné kalibrační soubory, protože mají vliv na účinnost zpětného rozptylu a distribuci světla v třepací baňce.

Obrázek 3: CGQuant a CGQ jako součástí senzoru v integrovaném systému pro měření biomasy za kultivaci v třepací baňce.

Shrnutí

Kontinuální měření biomasy v třepacích baňkách v reálném čase pozvedá bioprocesy na další úroveň, od kultivačního systému „černé skříňky“ po integrované řešení bioprocesu s přesnou kontrolou prostředí a úplnými informacemi o procesu od samého začátku. Nevhodný a nutně zásahový přístup, který byl dosud používán při ručním odběru vzorků, může přinejlepším poskytnout jen několik vodítek pro odhalení toho, co se během kultivace děje. Tato míra nejistoty by nebyla přijatelná u měření dalších veličin, jako je teplota nebo rychlost třepání - tak proč ji akceptovat jako nevyhnutelnou v případě biomasy? Použitý měřicí systém by měl být integrovanou součástí celého systému a zároveň zajišťovat jednoduchost, hospodárnost a správné provedení procesu.

Všechny obecně sdílené požadavky na takový systém umožňuje naplnit integrovaný systém pro monitorování biomasy INFORS HT. Měření neinvazivní, spolehlivou a jednoduše měřicí technologií založenou na zpětném rozptylu je přístupné pro velký počet organismů, médií, objemů a typů baněk. Důsledně regulovatelné parametry prostředí v třepačce třepačky působí společně s technikou měření biomasy, která poskytuje údaje o růstu za téměř všech kultivačních podmínek, a to i v hlučném prostředí baňky vystavené silnému třepání. Plně automatizovaný přístup k nastavení experimentu, kalibraci, zpracování dat a možnost porovnání více vstupů umožňuje snadnou přeměnu surových dat na použitelné informace o procesu a umožňuje hlubší porozumění bioprocesům. Aplikace pro monitorování biomasy na této úrovni spadají mimo jiné do několika hlavních kategorií:

  • Optimalizace růstu v čase, zkrácení času nebo množství experimentů
  • Možnost opuštění méně kvalitních manuálních metodologií
  • Možnost dosažení žádaného cíle hodnoty biomasy s indikaci, kdy k tomu dojde
  • Porovnávání kinetiky růstu pro identifikaci bioprocesových událostí, které byly v době ručního odběru vzorků neodhalitelné
  • Porovnání složení médií pro maximalizaci růstu
  • Sledování toxicity
  • Screening mutantů a profilování růstu
  • Validace biomasy v semenné kultuře, bez ohrožení sterility. Při tom je umožněno srovnání s předchozími dávkami pro indikaci exkurzí v procesu kultivace

Trend ve všech oblastech výzkumu a výroby směřuje k výrazné kontrole bioprocesů a k možnosti rychlejší reakce na změny probíhající v rámci procesu za přítomnosti jasné evidence pro to, co se během kultivace děje. Měření biomasy tyto výhody zpřístupňuje i pro standardní laboratorní třepací baňku.