K používání a měření webu využíváme cookies. Používáním tohoto webu souhlasíte se způsobem, jakým s cookies nakládáme. Další informace

Kontinuální kultivace jakožto univerzální bioproces pro výrobu

Kontinuální kultivace jakožto univerzální bioproces pro výrobu

V poslední době se kontinuální kultivace vyvinula z úzce specializované kultivační techniky v populární cestu k lepší automatizaci a kontrole v průmyslových bioprocesech. Ačkoliv jsme zatím pouze v začátcích, je zřejmé, že proces kontinuální kultivace má potenciál stát se “univerzálním bioprocesem”. Kontinuální kultivace je užitečná v případě, že disponujete geneticky stabilní populací mikroorganismů a produktem, který se dlouhodobě projevuje stálou rychlostí a beze změny. Tato metoda umožňuje dosáhnout maximální produktivity na dávku a snižuje celkovou dobu potřebnou pro čištění, sterilizaci a manipulaci s nádobou. V tomto článku představíme možné metodiky, vybavení a kontrolní strategie a odkážeme k hotovým řešením dostupným od INFORS HT

Úvod

Bioprocesy mikrobiálních a buněčných kultur mohou být prováděny několika způsoby v závislosti na technice přidávání a ubírání kapalin. Běžně jsou užívány techniky Batch, fed-batch a perfuze. Kontinuální kultivace je specifická tím, že je během ní po většinu času fermentace médium zároveň přidáváno a odebíráno tak, že jsou počty buněk zachovány v rovnováze.

 

Zastánci tohoto konceptu (např. Rathore a další, 2016) již delší dobu upozorňují, že aplikace metod kontinuální kultivace na jisté aplikace bioprocesů může mít závažné výhody co do ekonomičnosti, flexibility a automatizace - příkladem může být. produkce biosimiliars v buněčných kulturách savců (Langer & Rader, 2014). Kontinuální kultivace nebyla v minulých dekádách příliš populární mimo několik výzkumných skupin, které se zabývaly metabolickými studiemi, nebo vytvářely studie pro prokázání určité koncepce pro vývoj procesů v malém měřítku. Nápad vytvořit škálovatelný kontinuální proces pro průmyslovou výrobu byl znovu oživen až v poslední době: hlavní hnací silou bylo použití buněčných kultur pro monoklonální antitělesa nebo terapeutická produkce proteinů. Součástí tohoto přehodnocení bylo i opětovné promyšlení přínosu kontinuální kultivace jako obecné techniky produkce, která může zajistit snížení nákladů a umožnit přechod na vysoký stupeň automatizace.

 

Vývoj přístrojů pro bioprocesy začíná u jednoúčelových balíčků pro kontinuální kultivaci a perfuzi, protože každý nový proces musí být nejprve důkladně otestován v laboratorním měřítku. Nové metodologie, strategie kontroly a integrace následného zpracování tak mohou být vyvinuty před vytvořením jakéhokoliv závazku k výrobě ve větším měřítku. V případě maloobjemových a high-yield procesů může být měřítko poměrně skromné (desítky litrů) protože produktivita kontinuálního procesu je vysoká – v případě monoklonálních antitěles v koncentraci >1 g.L-1. Nepostradatelný je v tomto případě také software bioprocesů škálovatelný jak pro výzkumná, tak pro výrobní prostředí včetně možnosti přidávat metadata v návaznosti na kontrolu kvality a validaci. Zásadní je také možnost vzdáleného přístupu pro každý typ uživatele.

 

Postup tímto směrem nemůže být okamžitý a není možné ho provést v jediném kroku. Vývoj procesů v malém měřítku pro akademický a průmyslový výzkum je třeba učinit přístupný použití “soft senzorů”, které umožní nová řešení celkové kontroly bioprocesu, integraci hardwaru třetích stran a také plánování a experimentování v potenciálně velmi rozsáhlém měřítku.

Proč využívat kontinuální kultivaci?

Hodnota kontinuální kultivace jakožto metodologie vychází z jednoduché myšlenky, že individuální vlivy na růst a metabolismus buněk mohou být lépe prozkoumány ve chvíli, kdy pro ně udržujeme neměnné podmínky. V případě výrobního prostředí navíc kontinuální kultivace představuje procesní stav, který je přístupný kontrole a technikám hodnocení, jež jsou obtížně aplikovatelné na procesy s dynamickými fázemi. Na základě těchto dvou komplementárních vlastností můžeme nyní v několika bodech představit přehled aplikací ve vývoji a průmyslu stejně jako výhody plynoucí z užívání metody:

Výzkum:

  • Zkoumání v buněčné biologii, kde může sloužit jako zdroj pro velká množství uniformních buněk nebo proteinů
  • Obohacení pro specifické části bakteriálních mutantů jako např. auxotrofů, nebo mutantů odolných vůči antibiotikům nebo bakteriofágům pro další vědecký výzkum
  • Sběr dat o běžném stavu (steady state) organismu pro vytvoření matematického modelu vztaženého k jeho metabolickým procesům.
  • Studium metabolických strategií vyvíjených organismy s odlišnou rychlostí růstu v závislosti na frekvenci ředění
  • Analýza metabolických cest v případě hladovění, optimálního nasycení a přesycení látkou, která podmiňuje růst.

Průmysl

  • Časté využití při průmyslové výrobě ethanolu
  • Vývoj experimentálních modelů kontinuální kultivace v oblasti biotechnologií pro maximalizaci využití vybavení, minimalizaci downtime a zajištění podmínek kultivace, které jsou vhodné pro statistické metody kontroly procesů na základě modelů.

Výhody

  • Výměna média: Kontinuální výměna média zaručuje, že jsou buňky stále zásobovány čerstvými živinami. Mimo to je produkt odebírán již od začátku procesu a vedlejší produkty jako toxiny jsou průběžně odstraňovány. Výměna média navíc umožňuje zmírnit účinky změn v metabolismu buněk korelující s ustupující oblastí biologicky aktivního produktu v průběhu procesu - např. Špatné složení během glykosylace.
  • Zvýšení délky a rozsahu sklízení: délka fáze růstu/výroby může být prodloužena z několika dní na týdny nebo i měsíce.
  • Docílení fyziologicky stálého stavu: Všechny parametry kultury a metabolický status mikroorganismů zůstávají konstantní (μ, V, DO, cX, cS, cP, pH, …).
  • Menší bioreaktory mohou být využívány pro stejné množství produktu, což může mít velký dopad na ekonomické využití prostoru, služeb podpory a času obsluhy.
  • Účinné využití vybavení downstream processingu: kapacita tohoto vybavení může být rozšířena, když není přetížené žádné z “hrdel lahve” v procesní cestě.
  • Perfuze: Pomalu rostoucí buňky jsou udržovány v nádobě, což vede k snižování zdrojů nutných pro produkci semen. Kromě toho je roztok k následnému zpracování zbavený buněk, a tedy snadněji procesovatelný s využitím technik jako kolonová chromatografie, protože může být vynechán krok separace.

Adaptace pro kontinuální kultivaci:

Všechny větší kategorie mikroorganismů a buněk v kapalných kulturách jsou přizpůsobitelné k růstu prostřednictvím kontinuální kultivace. Některé metody mohou vyhovovat lépe než jiné v závislosti na aplikaci, ale pro všechny platí stejná obecná kritéria. Konkrétní adaptace, které se často provádí pro kontinuální kultivaci shrnujeme v tabulce 1.

Řešení Infors HT

Hotová řešení nabízená Infors HT pro kontinuální kultivace činí možným použití “rovnou po rozbalení”. Počínaje přístrojem Minifors 2 jsou bioreaktory Infors HT připraveny pro běžné strategie bioprocesů jako kontinuální kultivace. Minifors 2 nabízí 4 přerozdělovací pumpy, které zpřístupňují vyživování a sklízení na jedno kliknutí. Precizní kontrola frekvence vyživování umožňuje dlouhodobý chod se zajištěním správného dávkování a tím pádem také minimalizaci problémů jako promytí. Se sadami, které zajišťují všechno nutné „potrubí“ jako jsou hadičky a konektory, se neztrácí čas s hledáním správně velkých konektorů.

AdaptacePopis
Periferní vybavení Kontinuální kultivace vyžaduje užití periferního vybavení: lahví, konektorů a dalších. Návod k správnému nastavení je dostupný v dokumentaci.
Pumpy pro sklizeň Jako pumpa pro sklizeň může být nastavena přídavná pumpa nebo další integrované pumpy (např. antifoam) bez nutnosti instalace.
Malé nádoby Pro početné nebo paralelní experimenty jsou výhodou malé velikosti nádob, které zajistí udržení pracovního objemu na minimu.
Online měření biomasy Přidání senzorů pro měření biomasy v reálném čase např. za použití turbidity pro zachování maximální hustoty buněk v delších časových úsecích.
Spin filtr Použití zařízení na dělení buněk jako spin filtrů pro techniky perfuze pro zachování buněk v nádobě při odstraňování bezbuněčného supernatantu a nahrazení čerstvým médiem.
Paralelní a multi-modální Otevřená neustálá kontrola třepací baňky umožňuje paralelizaci kultur a v závislosti na jejich výsledcích také úpravy a simultánní sběr dat v reálném čase.

Tabulka 1. Přehled specifických adaptací, které se často využívají k provádění kontinuální kultivace, a jejich charakteristika.

Periferní vybavení

Všechno potřebné periferní vybavení jako např. lahve a spoje je součástí balíčku. Součástí mohou být také externí vzorkovače z odpadního proudu a aseptický sběr sklizně pro následné zpracování. Infors HT nabízí soubory potřebného hardwaru pro kontinuální kultivace a také prezentace, manuály nastavení a školení, které zajistí správné nastavení a ideální konfiguraci systému.

Pumpy pro sklizeň

Přiřazení integrovaných pump pro příkrm a sklizeň pro použití standardních systémů přímo z krabice. Antifoam pumpa může být nakonfigurována jako pumpa pro sklizeň. Samozřejmostí je také možnost přidání konfigurovatelných nádob s jinými řešeními odstraňování odtoku a využití externích pump. Mimo to je možné použít software eve® pro pokročilou kontrolu příkrmu a kontinuální monitoring toku a stupně nasycení.

Malé nádoby

Malé velikosti nádob umožňují udržení pracovního objemu na nejmenší možné hodnotě. Tento aspekt je obzvláště výhodný v případě početných nebo paralelně probíhajících experimentů pro vývoj a optimalizaci bioprocesů. S fluktuací 1–3 nádob denně pro typickou kontinuální kultivaci vystačí několik stovek mililitrů pracovního objemu ke konzumaci desítek litrů čerstvého média v průběhu 30 až 90 dní. Protože Multifors 2 využívá stejnou technologii jako bioreaktory s většími pracovními objemy, je risk rozdílů při přechodu na větší měřítko minimalizován.

Gravimetrický příkrm

Přesnost rychlosti toku dovnitř i ven může být ještě zvýšena v případě užití gravimetrického příkrmu, který umožňuje naprosto kontinuální práci se stabilním prostředím kultur udržovaným rychlostí přidávání jedné růst-omezující látky. K bioreaktorům INFORS HT mohou být připojeny také externí váhy, které mohou gravimetrický příkrm nastavit lokálně nebo v programu eve pro pokročilé možnosti dávkování ve srovnání s HMI.

Online měření biomasy

Přidání senzorů pro měření biomasy v reálném čase např. za použití turbidity pro zachování maximální hustoty buněk v delších časových úsecích. Senzory turbidity od společnosti Optek s různými optickými celami mohou být přímo napojeny na kontrolní jednotku s hodnotami měření zobrazenými na dotykovém displeji. Koncentrace biomasy může být udržována na konstantní hodnotě uvnitř systému např. prostřednictvím kontroly krmení založené na koncentraci biomasy v softwaru eve®.

Spin filtr

V případě využití zařízení na dělení buněk (jako např. spin filtrů) je možné provádět perfuzi kultury se zachováním buněk v nádobě během odstraňování bezbuněčného supernatantu a nahrazování čerstvým médiem. INFORS HT nabízí otáčivé filtry s velikostí od 10 μm pro Multifors 2 a Labfors 5 pro proces perfuze s pracovním objemem již od 180 ml. Tímto způsobem mohou být získána zásadní procesní data s nízkou spotřebou média ještě před rozšířením produkce. Spin filtry se často využívají v kombinaci s mikronosiči. pro zadržení buněk mohou být kromě spin filtrů využita i externí zařízení jako např. ATF filtr.

Soft senzory vztahující se ke kontinuální kultivaci

Soft senzory mohou poskytnout hodnotný vhled do průběhu bioprocesu kontinuální kultivace a pomoci vylepšit strategie krmení, vypočítat rychlost ředění a monitorovat naplněnost lahví. Flexibilní skriptovací prostředí umožňuje generování a využívání strategií pro kontrolu a interpretaci dat, které jsou vysoce modifikovatelné, přizpůsobitelné aplikaci nebo dokonce založené na specifickém modelu.

Shrnutí

Řešení nabízená společností INFORS HT umožňují využití výhod kontinuální kultivace ve výzkumu malého rozsahu a v laboratořích pro vývoj procesů v podobě několika předem hotových řešení. Mimo samotnou kontinuální kultivaci přístroj obstarává také separaci buněk přímo v nádobě a odtok využívající techniky perfuze. Přidáním sofistikovaných strategií kontroly procesu jako např. gravimetrického dávkování prostřednictvím eve softwaru vzniká kompletní balíček služeb.

Kontinuální kultivace byla po dekády využívána v rámci specializovaných aplikací, ať už pro studie zabývající se metabolismem, nebo pro optimalizaci zdrojů u produktů nízké hodnoty. Příchod farmaceutických aplikací zaměřujících se na produkci hodnotných a maloobjemových biologicky aktivních proteinů, jako např. monoklonálních antitělísek dal kontinuálním kulturám možnost zaujmout novou roli. Produkce biosimiliars v buňkách savců je v současnosti velmi důležitá aplikace, jejímž prvním úkolem je prozkoumání možností snížení nákladů a optimalizace procesu - balíčky INFORS HT pro tento krok představují ideální nástroj.