V poslední době se kontinuální kultivace vyvinula z úzce specializované kultivační techniky v populární cestu k lepší automatizaci a kontrole v průmyslových bioprocesech. Ačkoliv jsme zatím pouze v začátcích, je zřejmé, že proces kontinuální kultivace má potenciál stát se “univerzálním bioprocesem”. Kontinuální kultivace je užitečná v případě, že disponujete geneticky stabilní populací mikroorganismů a produktem, který se dlouhodobě projevuje stálou rychlostí a beze změny. Tato metoda umožňuje dosáhnout maximální produktivity na dávku a snižuje celkovou dobu potřebnou pro čištění, sterilizaci a manipulaci s nádobou. V tomto článku představíme možné metodiky, vybavení a kontrolní strategie a odkážeme k hotovým řešením dostupným od INFORS HT
Bioprocesy mikrobiálních a buněčných kultur mohou být prováděny několika způsoby v závislosti na technice přidávání a ubírání kapalin. Běžně jsou užívány techniky Batch, fed-batch a perfuze. Kontinuální kultivace je specifická tím, že je během ní po většinu času fermentace médium zároveň přidáváno a odebíráno tak, že jsou počty buněk zachovány v rovnováze.
Zastánci tohoto konceptu (např. Rathore a další, 2016) již delší dobu upozorňují, že aplikace metod kontinuální kultivace na jisté aplikace bioprocesů může mít závažné výhody co do ekonomičnosti, flexibility a automatizace - příkladem může být. produkce biosimiliars v buněčných kulturách savců (Langer & Rader, 2014). Kontinuální kultivace nebyla v minulých dekádách příliš populární mimo několik výzkumných skupin, které se zabývaly metabolickými studiemi, nebo vytvářely studie pro prokázání určité koncepce pro vývoj procesů v malém měřítku. Nápad vytvořit škálovatelný kontinuální proces pro průmyslovou výrobu byl znovu oživen až v poslední době: hlavní hnací silou bylo použití buněčných kultur pro monoklonální antitělesa nebo terapeutická produkce proteinů. Součástí tohoto přehodnocení bylo i opětovné promyšlení přínosu kontinuální kultivace jako obecné techniky produkce, která může zajistit snížení nákladů a umožnit přechod na vysoký stupeň automatizace.
Vývoj přístrojů pro bioprocesy začíná u jednoúčelových balíčků pro kontinuální kultivaci a perfuzi, protože každý nový proces musí být nejprve důkladně otestován v laboratorním měřítku. Nové metodologie, strategie kontroly a integrace následného zpracování tak mohou být vyvinuty před vytvořením jakéhokoliv závazku k výrobě ve větším měřítku. V případě maloobjemových a high-yield procesů může být měřítko poměrně skromné (desítky litrů) protože produktivita kontinuálního procesu je vysoká – v případě monoklonálních antitěles v koncentraci >1 g.L-1. Nepostradatelný je v tomto případě také software bioprocesů škálovatelný jak pro výzkumná, tak pro výrobní prostředí včetně možnosti přidávat metadata v návaznosti na kontrolu kvality a validaci. Zásadní je také možnost vzdáleného přístupu pro každý typ uživatele.
Postup tímto směrem nemůže být okamžitý a není možné ho provést v jediném kroku. Vývoj procesů v malém měřítku pro akademický a průmyslový výzkum je třeba učinit přístupný použití “soft senzorů”, které umožní nová řešení celkové kontroly bioprocesu, integraci hardwaru třetích stran a také plánování a experimentování v potenciálně velmi rozsáhlém měřítku.
Hodnota kontinuální kultivace jakožto metodologie vychází z jednoduché myšlenky, že individuální vlivy na růst a metabolismus buněk mohou být lépe prozkoumány ve chvíli, kdy pro ně udržujeme neměnné podmínky. V případě výrobního prostředí navíc kontinuální kultivace představuje procesní stav, který je přístupný kontrole a technikám hodnocení, jež jsou obtížně aplikovatelné na procesy s dynamickými fázemi. Na základě těchto dvou komplementárních vlastností můžeme nyní v několika bodech představit přehled aplikací ve vývoji a průmyslu stejně jako výhody plynoucí z užívání metody:
Výzkum:
Průmysl
Výhody
Všechny větší kategorie mikroorganismů a buněk v kapalných kulturách jsou přizpůsobitelné k růstu prostřednictvím kontinuální kultivace. Některé metody mohou vyhovovat lépe než jiné v závislosti na aplikaci, ale pro všechny platí stejná obecná kritéria. Konkrétní adaptace, které se často provádí pro kontinuální kultivaci shrnujeme v tabulce 1.
Hotová řešení nabízená Infors HT pro kontinuální kultivace činí možným použití “rovnou po rozbalení”. Počínaje přístrojem Minifors 2 jsou bioreaktory Infors HT připraveny pro běžné strategie bioprocesů jako kontinuální kultivace. Minifors 2 nabízí 4 přerozdělovací pumpy, které zpřístupňují vyživování a sklízení na jedno kliknutí. Precizní kontrola frekvence vyživování umožňuje dlouhodobý chod se zajištěním správného dávkování a tím pádem také minimalizaci problémů jako promytí. Se sadami, které zajišťují všechno nutné „potrubí“ jako jsou hadičky a konektory, se neztrácí čas s hledáním správně velkých konektorů.
| Adaptace | Popis |
|---|---|
| Periferní vybavení | Kontinuální kultivace vyžaduje užití periferního vybavení: lahví, konektorů a dalších. Návod k správnému nastavení je dostupný v dokumentaci. |
| Pumpy pro sklizeň | Jako pumpa pro sklizeň může být nastavena přídavná pumpa nebo další integrované pumpy (např. antifoam) bez nutnosti instalace. |
| Malé nádoby | Pro početné nebo paralelní experimenty jsou výhodou malé velikosti nádob, které zajistí udržení pracovního objemu na minimu. |
| Online měření biomasy | Přidání senzorů pro měření biomasy v reálném čase např. za použití turbidity pro zachování maximální hustoty buněk v delších časových úsecích. |
| Spin filtr | Použití zařízení na dělení buněk jako spin filtrů pro techniky perfuze pro zachování buněk v nádobě při odstraňování bezbuněčného supernatantu a nahrazení čerstvým médiem. |
| Paralelní a multi-modální | Otevřená neustálá kontrola třepací baňky umožňuje paralelizaci kultur a v závislosti na jejich výsledcích také úpravy a simultánní sběr dat v reálném čase. |
Tabulka 1. Přehled specifických adaptací, které se často využívají k provádění kontinuální kultivace, a jejich charakteristika.
Všechno potřebné periferní vybavení jako např. lahve a spoje je součástí balíčku. Součástí mohou být také externí vzorkovače z odpadního proudu a aseptický sběr sklizně pro následné zpracování. Infors HT nabízí soubory potřebného hardwaru pro kontinuální kultivace a také prezentace, manuály nastavení a školení, které zajistí správné nastavení a ideální konfiguraci systému.
Přiřazení integrovaných pump pro příkrm a sklizeň pro použití standardních systémů přímo z krabice. Antifoam pumpa může být nakonfigurována jako pumpa pro sklizeň. Samozřejmostí je také možnost přidání konfigurovatelných nádob s jinými řešeními odstraňování odtoku a využití externích pump. Mimo to je možné použít software eve® pro pokročilou kontrolu příkrmu a kontinuální monitoring toku a stupně nasycení.
Malé velikosti nádob umožňují udržení pracovního objemu na nejmenší možné hodnotě. Tento aspekt je obzvláště výhodný v případě početných nebo paralelně probíhajících experimentů pro vývoj a optimalizaci bioprocesů. S fluktuací 1–3 nádob denně pro typickou kontinuální kultivaci vystačí několik stovek mililitrů pracovního objemu ke konzumaci desítek litrů čerstvého média v průběhu 30 až 90 dní. Protože Multifors 2 využívá stejnou technologii jako bioreaktory s většími pracovními objemy, je risk rozdílů při přechodu na větší měřítko minimalizován.
Přesnost rychlosti toku dovnitř i ven může být ještě zvýšena v případě užití gravimetrického příkrmu, který umožňuje naprosto kontinuální práci se stabilním prostředím kultur udržovaným rychlostí přidávání jedné růst-omezující látky. K bioreaktorům INFORS HT mohou být připojeny také externí váhy, které mohou gravimetrický příkrm nastavit lokálně nebo v programu eve pro pokročilé možnosti dávkování ve srovnání s HMI.
Přidání senzorů pro měření biomasy v reálném čase např. za použití turbidity pro zachování maximální hustoty buněk v delších časových úsecích. Senzory turbidity od společnosti Optek s různými optickými celami mohou být přímo napojeny na kontrolní jednotku s hodnotami měření zobrazenými na dotykovém displeji. Koncentrace biomasy může být udržována na konstantní hodnotě uvnitř systému např. prostřednictvím kontroly krmení založené na koncentraci biomasy v softwaru eve®.
V případě využití zařízení na dělení buněk (jako např. spin filtrů) je možné provádět perfuzi kultury se zachováním buněk v nádobě během odstraňování bezbuněčného supernatantu a nahrazování čerstvým médiem. INFORS HT nabízí otáčivé filtry s velikostí od 10 μm pro Multifors 2 a Labfors 5 pro proces perfuze s pracovním objemem již od 180 ml. Tímto způsobem mohou být získána zásadní procesní data s nízkou spotřebou média ještě před rozšířením produkce. Spin filtry se často využívají v kombinaci s mikronosiči. pro zadržení buněk mohou být kromě spin filtrů využita i externí zařízení jako např. ATF filtr.
Soft senzory mohou poskytnout hodnotný vhled do průběhu bioprocesu kontinuální kultivace a pomoci vylepšit strategie krmení, vypočítat rychlost ředění a monitorovat naplněnost lahví. Flexibilní skriptovací prostředí umožňuje generování a využívání strategií pro kontrolu a interpretaci dat, které jsou vysoce modifikovatelné, přizpůsobitelné aplikaci nebo dokonce založené na specifickém modelu.
Řešení nabízená společností INFORS HT umožňují využití výhod kontinuální kultivace ve výzkumu malého rozsahu a v laboratořích pro vývoj procesů v podobě několika předem hotových řešení. Mimo samotnou kontinuální kultivaci přístroj obstarává také separaci buněk přímo v nádobě a odtok využívající techniky perfuze. Přidáním sofistikovaných strategií kontroly procesu jako např. gravimetrického dávkování prostřednictvím eve softwaru vzniká kompletní balíček služeb.
Kontinuální kultivace byla po dekády využívána v rámci specializovaných aplikací, ať už pro studie zabývající se metabolismem, nebo pro optimalizaci zdrojů u produktů nízké hodnoty. Příchod farmaceutických aplikací zaměřujících se na produkci hodnotných a maloobjemových biologicky aktivních proteinů, jako např. monoklonálních antitělísek dal kontinuálním kulturám možnost zaujmout novou roli. Produkce biosimiliars v buňkách savců je v současnosti velmi důležitá aplikace, jejímž prvním úkolem je prozkoumání možností snížení nákladů a optimalizace procesu - balíčky INFORS HT pro tento krok představují ideální nástroj.